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Technik zur Wiederherstellung verlorener Einzelzell-RNA-Sequenzierungsinformationen

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BILD: MIT-Forscher haben die Informationsmenge, die mit Seq-Well, einer Technik zur schnellen Sequenzierung von RNA aus einzelnen Zellen, erhalten werden kann, erheblich gesteigert. Dieser Fortschritt sollte es Wissenschaftlern ermöglichen, … zu sehen Mehr

Bildnachweis: MIT

CAMBRIDGE, MA – Die Sequenzierung von RNA aus einzelnen Zellen kann viele Informationen darüber liefern, was diese Zellen im Körper tun. MIT-Forscher haben jetzt die Menge an Informationen, die aus jeder dieser Zellen gewonnen wurden, erheblich verbessert, indem sie die häufig verwendete Seq-Well-Technik modifiziert haben.

Mit ihrem neuen Ansatz konnte das MIT-Team zehnmal so viele Informationen aus jeder Zelle in einer Probe extrahieren. Dieser Anstieg sollte es Wissenschaftlern ermöglichen, viel mehr über die Gene zu erfahren, die in jeder Zelle exprimiert werden, und ihnen helfen, subtile, aber kritische Unterschiede zwischen gesunden und dysfunktionellen Zellen zu entdecken.

„Es ist klar geworden, dass diese Technologien ein transformatives Potenzial für das Verständnis komplexer biologischer Systeme haben. Wenn wir eine Reihe verschiedener Datensätze betrachten, können wir die Landschaft von Gesundheit und Krankheit wirklich verstehen und uns Informationen darüber geben, welche therapeutischen Strategien wir möglicherweise anwenden beschäftigen „, sagt Alex K. Shalek, außerordentlicher Professor für Chemie, Kernmitglied des Instituts für Medizintechnik und Wissenschaft (IMES) und extramurales Mitglied des Koch-Instituts für integrative Krebsforschung am MIT. Er ist außerdem Mitglied des Ragon Institute von MGH, MIT und Harvard sowie Institutsmitglied des Broad Institute.

In einer Studie, die diese Woche in erscheint ImmunitätDas Forscherteam demonstrierte die Leistungsfähigkeit dieser Technik, indem es ungefähr 40.000 Zellen von Patienten mit fünf verschiedenen Hauterkrankungen analysierte. Ihre Analyse von Immunzellen und anderen Zelltypen ergab viele Unterschiede zwischen den fünf Krankheiten sowie einige Gemeinsamkeiten.

„Dies ist keineswegs ein erschöpfendes Kompendium, aber es ist ein erster Schritt zum Verständnis des Spektrums entzündlicher Phänotypen, nicht nur innerhalb von Immunzellen, sondern auch innerhalb anderer Hautzelltypen“, sagt Travis Hughes, MD / PhD-Student in Harvard -MIT-Programm in Gesundheitswissenschaften und -technologie und einer der Hauptautoren des Papiers.

Shalek und J. Christopher Love, der Raymond A. und Helen E. St. Laurent Professor für Chemieingenieurwesen und Mitglied des Koch Institute und des Ragon Institute, sind die leitenden Autoren der Studie. Der MIT-Doktorand Marc Wadsworth und der ehemalige Postdoc Todd Gierahn sind gemeinsam mit Hughes die Hauptautoren der Arbeit.

Informationen neu erfassen

Vor einigen Jahren haben Shalek, Love und ihre Kollegen eine Methode namens Seq-Well entwickelt, mit der RNA aus vielen einzelnen Zellen gleichzeitig schnell sequenziert werden kann. Diese Technik erfasst, wie andere Ansätze mit hohem Durchsatz, nicht so viele Informationen pro Zelle wie einige langsamere, teurere Methoden zur Sequenzierung von RNA. In ihrer aktuellen Studie machten sich die Forscher daran, einige der Informationen, die in der Originalversion fehlten, wieder zu erfassen.

„Wenn Sie wirklich Merkmale auflösen möchten, die Krankheiten unterscheiden, benötigen Sie eine höhere Auflösung als möglich“, sagt Love. „Wenn Sie sich Zellen als Informationspakete vorstellen, erhalten Sie durch die genauere Messung dieser Informationen viel bessere Einblicke in die Zellpopulationen, auf die Sie möglicherweise für Arzneimittelbehandlungen abzielen möchten, oder unter diagnostischen Gesichtspunkten, welche Sie überwachen sollten.“

Um diese zusätzlichen Informationen wiederherzustellen, konzentrierten sich die Forscher auf einen Schritt, bei dem sie wussten, dass Daten verloren gingen. In diesem Schritt werden cDNA-Moleküle, die Kopien der RNA-Transkripte von jeder Zelle sind, durch einen Prozess amplifiziert, der als Polymerasekettenreaktion (PCR) bezeichnet wird. Diese Amplifikation ist notwendig, um genügend Kopien der DNA für die Sequenzierung zu erhalten. Es wurde jedoch nicht die gesamte cDNA amplifiziert. Um die Anzahl der Moleküle zu erhöhen, die es über diesen Schritt hinaus geschafft haben, haben die Forscher geändert, wie sie die cDNA mit einer zweiten „Primer“ -Sequenz markiert haben, was es PCR-Enzymen erleichtert, diese Moleküle zu amplifizieren.

Mit dieser Technik zeigten die Forscher, dass sie pro Zelle viel mehr Informationen generieren können. Sie sahen eine Verfünffachung der Anzahl der Gene, die nachgewiesen werden konnten, und eine Verzehnfachung der Anzahl der pro Zelle gewonnenen RNA-Transkripte. Diese zusätzlichen Informationen über wichtige Gene, wie jene, die Zytokine, Rezeptoren auf Zelloberflächen und Transkriptionsfaktoren codieren, ermöglichen es den Forschern, subtile Unterschiede zwischen Zellen zu identifizieren.

„Mit einem wirklich einfachen molekularbiologischen Trick, der sich leicht in den bestehenden Workflow integrieren ließ, konnten wir den Informationsgehalt pro Zelle erheblich verbessern“, sagt Hughes.

Signaturen der Krankheit

Mit dieser Technik analysierten die Forscher 19 Hautbiopsien von Patienten, die fünf verschiedene Hauterkrankungen repräsentierten – Psoriasis, Akne, Lepra, Alopecia areata (eine Autoimmunerkrankung, die Haarausfall verursacht) und Granuloma annulare (eine chronisch degenerative Hauterkrankung). Sie deckten einige Ähnlichkeiten zwischen Erkrankungen auf – zum Beispiel schienen ähnliche Populationen entzündlicher T-Zellen sowohl bei Lepra als auch bei Granuloma annulare aktiv zu sein.

Sie deckten auch einige Merkmale auf, die für eine bestimmte Krankheit einzigartig waren. In Zellen von mehreren Psoriasis-Patienten fanden sie heraus, dass Keratinozyten genannte Zellen Gene exprimieren, die es ihnen ermöglichen, sich zu vermehren und die bei dieser Krankheit beobachtete Entzündung anzutreiben.

Die in dieser Studie generierten Daten sollten auch anderen Forschern eine wertvolle Ressource bieten, die sich eingehender mit den biologischen Unterschieden zwischen den untersuchten Zelltypen befassen möchten.

„Man weiß nie, wofür man diese Datensätze verwenden möchte, aber es gibt eine enorme Chance, alles gemessen zu haben“, sagt Shalek. „Wenn wir sie in Zukunft wiederverwenden und über bestimmte Oberflächenrezeptoren, Liganden, Proteasen oder andere Gene nachdenken müssen, haben wir all diese Informationen zur Hand.“

Die Technik könnte auch auf viele andere Krankheiten und Zelltypen angewendet werden, sagen die Forscher. Sie haben damit begonnen, Krebs und Infektionskrankheiten wie Tuberkulose, Malaria, HIV und Ebola zu untersuchen, und sie verwenden es auch zur Analyse von Immunzellen, die an Lebensmittelallergien beteiligt sind. Sie haben die neue Technik auch anderen Forschern zur Verfügung gestellt, die sie verwenden oder den zugrunde liegenden Ansatz für ihre eigenen Einzelzellstudien anpassen möchten.

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Die Forschung wurde vom Koch Institute Support (Core) Grant der National Institutes of Health, dem Bridge Project des Koch Institute und dem Dana-Farber / Harvard Cancer Center, der Food Allergy Science Initiative des Broad Institute, den National Institutes, finanziert of Health, ein Beckman Young Investigator Award, ein Sloan Research Fellowship in Chemistry, der Pew-Stewart Scholar Award und die Bill and Melinda Gates Foundation.

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